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桂花叶斑病病原鉴定及其生物学特性研究_王晓梅

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桂花小苗

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发表于 2014-5-16 09:25:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
    摘 要:从桂花(Osmamthus fragrans)叶斑病病斑上分离得到叶点霉病原菌,对病原菌形态特征进行观察,经鉴定该病原菌为变叶木叶点霉(Phyllosticta ghaesembillaeKoorders)。同时对该病原菌的致病性及其生物学特性进行了研究。结果表明:pH3~11条件下均适宜该病原菌菌丝生长,最适合孢子萌发的为pH9。菌丝生长和分生孢子器形成的最适温度为25℃ ,分生孢子萌发的最适温度为20℃。光照对该病原菌的菌丝生长无显著影响,黑暗对孢子的萌发有一定促进作用。该病原菌可利用多种单糖、双糖、多糖等碳源,但这些碳源对病原菌的生长无显著影响,只对孢子萌发率有一定的影响。同时该病原菌也能利用有机氮、无机氮等氮源,最适氮源为硝酸钾,硫酸铵和氯化铵会抑制病原菌菌丝生长。菌丝致死温度为60℃。
    桂花(Osmamthus fragrans)是木犀科木犀属的常绿乔木,在我国有着悠久的栽培历史,是我国的十大传统名花之一。桂花叶斑病类病害是桂花的常见病害,严重时会导致全叶枯死,对桂花的经济价值和观赏价值影响较大,但目前对桂花叶斑病类病害的研究甚少,只有一些简单的记载,对该病的病原菌及其致病机理的研究也不多,因此有必要对桂花病害进行深入研究,以指导生产实践。本试验对桂花叶斑病病原菌进行分离纯化和鉴定,并对其生物学特性进行研究,为综合防治桂花叶斑病提供理论依据。
    1 材料与方法
    1.1 病原菌的鉴定
    切取病斑,制作徒手切片,显微镜下观察病原菌形态等,显微照相记录病原菌特征,进行病原菌鉴定。
    1.2 病原菌的分离与培养
    采用常规组织分离方法分离病原菌[12],在新鲜发病叶的病健交界处剪下小块组织,放在75%乙醇中消毒30 s,再转到1%的升汞溶液消毒3次,每次30 s。然后用无菌水漂洗3次,每次1 min,最后将小块组织放在已消毒的滤纸上吸干水份。转至PDA培养基上25℃培养。
    1.3 致病性测定
    采用柯赫氏法则测定病原菌的致病性[13]。剪取健康植株的一小分支,然后用75%的乙醇对叶片进行表面消毒,再用无菌水清洗,晾干后,用剪刀在叶片上剪出伤口,将菌悬液喷洒于叶片伤口上,以未喷洒菌悬液的植株做对照,在室温下培养,待叶片表现症状后对病斑进行组织分离,在显微镜下观察分离到的病菌是否与接种的病菌相同。
    1.4 病原菌的生物学特性研究
    1.4.1 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响试验 试验在无菌条件下,用1 mol/L的NaOH和HCl调节培养基的pH,设置3,5,7,9,11 5个pH梯度。挑取直径为5 mm的菌块,分别接种于不同pH值的PDA培养基平板中。每个处理3次重复,以自然pH值做对照。在25℃条件下培养,8 d后用十字交叉法测量菌落直径,并记载菌落形态、基质颜色及分生孢子器情况。将在不同pH值的PDA上产生的分生孢子器压破,制成孢子悬浮液,在每一培养皿(培养皿内径为85 mm)加7.5 mL1%蔗糖溶液和2滴孢子悬浮液,置于各处理pH值下培养12,24 h,计算孢子萌发率。
    1.4.2 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响试验 试验在无菌条件下,将直径为5 mm的菌块分别接种于PDA平板培养基中央,分别置于10,15,20,25,30,35,40℃的恒温培养箱中培养。每个处理3次重复,8 d后用十字交叉法测量菌落直径,并记载菌落形态、基质颜色及分生孢子器情况。将在PDA上产生的分生孢子器压破,制成孢子悬浮液,在每一培养皿(培养皿内径为85 mm)加7.5 mL1%蔗糖溶液和2滴孢子悬浮液,置于各处理温度下培养12,24 h,计算孢子萌发率。
    1.4.3 光照对菌丝生长和孢子萌发的影响试验 试验在无菌条件下,将直径为5 mm的菌块接种到PDA平板上,分别置于连续荧光、连续黑暗、12 h荧光/12 h黑暗交替和自然光4个处理,每个处理3次重复,8 d后用十字交叉法测量菌落直径,记载菌落形态、基质颜色及分生孢子器情况。将在PDA上产生的分生孢子器压破,制成孢子悬浮液,在每一培养皿加7.5 mL 1%蔗糖溶液和2滴孢子悬浮液,置于各处理下培养12,24 h,计算孢子萌发率。
    1.4.4 碳源、氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响试验 
    (1)碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响。试验以PDA为对照,用乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖取代PDA中的葡萄糖,用量以15.0 g葡萄糖中的含碳量为标准进行换算,制备培养基。将直径为5 mm的菌块分别置于不同碳源培养基中,在25℃条件下培养,每个处理3次重复,以PDA为对照,8 d后用十字交叉法测量菌落直径,并记载菌落形态、基质颜色及分生孢子器情况。将不同处理产生的分生孢子器压破,制成孢子悬浮液,在每一培养皿加7.5 mL1%蔗糖溶液和2滴孢子悬浮液,置于各处理pH值下培养12,24 h,计算孢子萌发率。
    (2)氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响。试验以Richard基本培养基为对照,以Richard为基本培养基,氮源分别用(NH4)2SO4、NH4Cl、天门冬酰胺、谷氨酸代替KNO3,用量以10.0 g KNO3中的含氮量为标准进行换算,制备培养基。将直径为5 mm的菌块分别置于不同氮源培养基中,在25℃条件下培养,每个处理3次重复,以PDA为对照。8 d后用十字交叉法测量菌落直径,并记载菌落形态、基质颜色及分生孢子器情况。将不同处理产生的分生孢子器压破,制成孢子悬浮液,在每一培养皿加7.5 mL1%蔗糖溶液和2滴孢子悬浮液,置于各处理pH值下培养12,24 h,计算孢子萌发率。
    1.4.5 菌丝致死温度的测定 试验在无菌条件下,将直径为5 mm的菌块分别放入已灭菌的小试管中,加入2 mL无菌水,在温度梯度为40,45,50,55,60,65,70,75℃恒温水浴处理10 min,每个处理3次重复。然后,将菌块取出移至PDA培养基中,在25℃条件下培养,10 d后观察记录菌落生长情况。
    2 结果与分析
    2.1 桂花枯斑病病原菌鉴定结果
    2.1.1 桂花叶部病害症状 在叶尖和叶缘出现病斑,病斑较大,不规则形,向叶内发展,灰褐色,边缘深褐色,病斑可联成一片达叶片面积1/2以上,后期病斑上散生黑色小点(病菌的分生孢子器),叶片干枯易碎,有时卷曲。
    2.1.2 病原菌的形态特征及鉴定 切取病斑,制作徒手切片。显微镜观察,黑褐色的小点为病原菌的孢子器,分生孢子器球形至扁球形,直径110~130μm,高70~80μm,初期无孔口,随后长出孔口;分生孢子椭圆形,两端钝,无色,单胞,大小4~5.5×2~3μm;产孢细胞单胞,无色。经鉴定该菌为变叶木叶点霉(Phyllosticta ghaesembillaeKoorders)。
    2.2 病原菌分离培养
    经PDA培养基培养后,病原菌株在PDA培养基上平铺,菌丝为近白色,初期菌落为白色,之后菌落逐渐出现红褐色的小点(分生孢子器),最后菌落土黄色,分生孢子器由红褐色变成黑褐色。分生孢子单胞,无色,椭圆形,无油球。分生孢子器直径110~130μm,高70~80μm,分生孢子大小4~5.5×2~3μm。
    2.3 致病性测定
    接种后的植株数天后叶片伤口处开始有病斑出现,并且产生黑色的小颗粒状物。从发病的病叶上重新组织分离,在相同培养条件下培养,得到病原菌。经观察得到该菌的分生孢子形态、大小、颜色均与当初接种的病菌相同,根据柯赫氏法则证明该病菌为致病菌。
    2.4 病原菌的生物学特性
    2.4.1 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响 病原菌菌丝生长对pH不太敏感,在pH 3~11条件下均能生长。试验中发现,中性偏碱(pH7,9,11)培养基上,菌丝生长较快较稳定,在pH7,9,11条件下菌丝均呈放射线生长,基质颜色逐渐加深,均在第2天开始长出白色的菌丝,第5天长出红褐色的孢子器,到第8天中间的红褐色孢子器逐渐变成黑色,边缘呈红褐色,菌落呈土黄色,绒毛状。相比之下,在偏酸的培养基上,菌丝生长更缓慢,在pH3和pH 5条件下均在第2天产生白色菌丝,在pH5条件下第5天产生红褐色孢子器,第8天内层的红褐色孢子器变成黑色,外层为红褐色,菌落呈圆形或近圆形,土黄色,绒毛状。pH 3条件下第3天长出菌丝,菌丝散落,第6天产生孢子器,第8天菌落呈淡黄色,略带少许红色(表1:pH3为液体培养基,未记录菌落生长直径。每一处理下的每个数据为3次重复的平均值)。
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    表1结果表明,当培养基呈碱性的时候,对菌丝的生长无显著影响,第3天以后,菌丝快速增长,每天增长约10 mm。当培养基呈酸性时,菌丝生长缓慢。
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    表2结果表明,病原菌在pH 3,5,7,11条件下,培养12 h孢子萌发率都很低,只有在pH9条件下才有较高的萌发率,培养24 h后,在pH3,5,7条件下,孢子萌发率也只有微量提高,pH 9,11条件下,孢子萌发率提高约1倍,pH 9时达到了36.2%,可以得出孢子萌发最适pH值为9。
    2.4.2 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响 试验结果表明,变叶木叶点霉菌可以在较宽的温度范围内生长,在10~30℃均能生长,温度为5℃和35℃时停止生长,但温度为10℃和15℃时只长菌丝不长分生孢子器,温度为10℃时,第4天开始长白色的菌丝,菌落呈放射线生长,到第8天菌落表面仍只有白色的菌丝,菌落呈土黄色,圆形或近圆形。温度为15℃时,第3天开始长出白色菌丝,菌落呈放射线生长,到第8天,菌落正面呈土黄色,圆形或近圆形,背面外层为白色菌丝,中间呈青绿色,依然没有黑色的孢子器。温度为20℃时,第3天开始长出白色菌丝,第5天长出黑色的孢子器,到第8天菌落正面呈土黄色,圆形或近圆形,背面外层为白色菌丝,中间有黑色的孢子器,基质颜色呈青绿色。温度为25℃和30℃时,第2天便产生白色的菌丝,第4天产生红褐色的孢子器,菌落呈放射线生长,到第8天,菌落正面呈土黄色,25℃呈圆形或近圆形,但在30℃时呈不规则的类似多边形的形状,背面外层都有红褐色的孢子器,内层原来的红褐色变为黑色。
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    表3(每一处理下的每个数据为3次重复的平均值)结果表明,病原菌在10~30℃均能生长,高于35℃或低于5℃均不生长,在25℃时生长最快,可以确定病原菌的最适温度为25℃。
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    表4结果表明,病原菌在10~30℃均能使孢子萌发,20℃孢子萌发率最高,随着温度的升高,孢子萌发率逐渐降低。
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    2.4.3 光照对菌丝生长和孢子萌发的影响 由表5可见,试验各处理都比较适合病原菌生长,24 h黑暗条件下病原菌的生长速率仅比自然光多0.04 mm,24 h荧光、12 h光暗交替也仅比自然光略少。这说明光照条件对菌丝的生长影响不大。从孢子萌发率看,24 h荧光、12 h光暗交替,与自然光相差不多,但24 h全黑暗明显高于自然光,说明24 h全黑暗有利于病原菌孢子的萌发。
    2.4.4 碳源、氮源对菌丝生长的影响 
    (1)碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响。病原菌在不同的碳源下都能较好地生长,5种碳源都在第2天产生白色的菌丝,第4天开始长出红褐色的分生孢子器,随着时间的延长,红褐色的孢子器逐渐变成黑褐色,到第8天菌落呈圆形或近圆形,有轮纹,土黄色。
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    表6结果表明,病原菌在各个碳源固体培养基上,菌丝生长状况顺序为葡萄糖>果糖>麦芽糖>蔗糖。但菌丝生长量的差别不大,最多也只差0.43 mm,说明不同的碳源对病原菌菌丝的生长影响不大。从孢子萌发率来看,葡萄糖不管是12 h和24 h的萌发率都明显高于其他碳源,说明在不同的碳源上,最适碳源为葡萄糖。
    (2)氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响。病原菌在不同氮源的培养基上,只在KNO3上能正常生长,在其上第2天上便产生白色的菌丝,第4天开始长出红褐色的孢子器,原来5 mm的黑色菌块从背面看变成红色。第8天,菌落呈暗红色,圆形或近圆形,绒毛状。天门冬酰胺在第3天长出了少许菌丝,随时间延长,菌落变大,但不形成孢子器,到第8天,仍然未长出孢子器,菌落呈圆形或近圆形土黄偏红的颜色。NH4Cl和(NH4)2SO4的培养基上,病原菌在第3天便产生白色的菌丝,并且菌落中间原来5 mm的黑色菌块变成红色。到第8天,菌落并没有明显的增长,从正面看菌落呈土黄色,背面看菌落呈粉红色,并没有产生孢子器。在谷氨酸培养基上(液体培养基),病原菌到第4天开始长出红色偏黄的菌丝,随着时间的延长菌丝到处散落,到第8天几乎铺满整个培养皿,但没有长出孢子器。表7结果表明,病原菌在各个氮源培养基上,菌丝生长从最好到最次依次为KNO3>天门冬酰胺>(NH4)2SO4>NH4Cl。但是,来自铵盐的氮源会对病原菌的生长起抑制作用,菌丝长得很慢,并且不长孢子器,来自天门冬酰胺的氮源虽然能正常长出菌丝,但不长孢子器。从孢子萌发率看,只有KNO3长出孢子器,但培养12 h和24 h萌发率都不高。
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    2.4.5 菌丝的致死温度 由表8可见,病原菌经过水浴后,或多或少地对菌丝的生长产生影响,经过40,50℃ ,菌丝生长都会比正常的稍慢,55℃比前两者更慢一些,只有45℃时与正常的PDA(对照)速率相当。60℃以上菌丝不生长,由此得出病原菌的致死温度为60℃。
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    3 结 论
    研究病原物的生物学特性在理论和实践上均有重要意义。本试验首次较为系统地研究了引起桂花叶斑病的病原菌———变叶木叶点霉Phyl-losticta ghaesembillaeKoorders在不同pH、温度、光照、氮源、碳源处理下对菌丝的影响和孢子萌发率的影响及其致死温度。明确了该菌生长所需的营养条件和环境因素,为掌握桂花叶斑病的发生规律与防治提供了一定的科学依据。
    本研究结果表明,病菌的pH范围较广,pH3~9均适合菌丝生长,这一特性增强了病菌在不同基质和土壤中的生存能力,从而有利于病害的发生,且在pH9时孢子萌发率最高,在防治时要特别注意中性偏碱环境下的防治。
    变叶木叶点霉(Phyllosticta ghaesembillaeKo-orders)菌丝生长、分生孢子器形成和分生孢子萌发的温度要求不完全一致。菌丝生长和分生孢子器形成的最适温度为25℃ ,而分生孢子萌发的最适温度则为20℃ ,萌发率极高。与菌丝生长和分生孢子萌发(10~30℃)相比,分生孢子器形成的温度范围(15~30℃)较窄。这些差异可能与菌丝生长、分生孢子器形成和分生孢子萌发的生理代谢不同有关。
    光暗交替、黑暗和全光照条件下,菌丝生长、分生孢子器形成都很好。持续光照虽对分生孢子器形成无影响,但对分生孢子萌发有一定的抑制作用,黑暗对孢子的萌发有一定促进作用。
    病原菌可利用多种单糖、双糖、多糖等碳源,但这些碳源对病原菌的生长无显著影响,只对孢子萌发率有影响,在葡萄糖下萌发率明显高于其他碳源,同时也能利用有机氮、无机氮等氮源,最适宜氮源为硝酸钾,硫酸铵和氯化铵会抑制病原菌菌丝生长。菌丝的致死温度为60℃。
    综上所述,在防治桂花叶斑病时,要在中性偏碱条件下进行。另外,由于铵盐中的氮源可以抑制菌丝的生长,可以考虑日常施用氮肥应以铵态氮为主,或者使用氯化铵、硫酸铵等作为增效剂,来提高化学药剂和生物农药对桂花叶枯病的防治效果。

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