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桂花叶枯病病原菌鉴定及生物学特性研究_袁蒲英

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桂花小苗

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发表于 2014-5-18 10:25:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
    摘要:对桂花叶枯病病原菌进行形态鉴定及生物学特性研究结果表明,桂花叶枯病的病原菌为细极链格孢[Alter-nariatenuissima(Fr.)Wiltshire],该菌在PDBA培养基上菌丝生长量最大,在OLA上产孢量最大。碳源以糊精最适于菌丝生长,肌醇最适于产孢。氮源以蛋白胨最适于菌丝生长与产孢,而铵盐会抑制病原菌生长及产孢。缺Mg不利于菌丝生长,缺K不利于产孢,添加一定量Zn、Ve可促进菌丝生长,添加Cu、Vb2可促进产孢。pH5~10适于菌丝生长而pH6~11适于产孢,最适pH值分别为pH6和pH7,该菌生长适温为20℃ ~30℃ ,最适生长温度为25℃~27℃ ,15℃和30℃适合产孢,30℃时产孢量最大,黑暗有利于菌丝生长及产孢。桂花叶汁、蔗糖、葡萄糖、牛肉浸膏促进孢子萌发效果最好,孢子萌发适宜温度为23℃ ~30℃ ,最适为27℃ ,适宜湿度为98%和100%,最适为98%,适宜pH值为pH3~7,最适为pH6,分生孢子致死温度为55℃10min。
    桂花(Osmanthusfragrans(thumb.)Lour.)又名木犀、岩桂,属木犀科(Oleaceae)木犀属(OsmanthusLour.),为常绿灌木至小乔木,是我国传统十大名花之一。花期正值仲秋,香飘数里,且桂花的花可作香料,又是食品加工业的重要原料,亦可入药[1]。但桂花也常常受到诸多病菌的侵染而表现生长不良甚至死亡,如由木樨生尾孢[CerosporaosmanthicolaP.K.ChietPai]引起的桂花褐斑病[2];由木樨生叶点霉[PhyllostictaosmanthicolaTrain.]引起的桂花枯斑病[2]。桂花叶枯病主要侵染桂花叶片,病害从叶缘或叶尖发生,初期出现圆形或不规则形大斑块,灰褐色,边缘深褐色,以后病斑逐渐汇合,形成大斑块,发病后期病斑上密生黑色霉层,严重时引起大量叶片干枯脱落。目前,国内外对桂花叶枯病的病原鉴定及其生物学特性研究报道极少,仅有一些简单的记载说明链格孢菌能引起桂花病害[3,4],但未进行详细研究。为此本文对桂花叶枯病进行病原菌分离纯化和鉴定,并对其生物学特性进行了较全面的研究,为综合防治桂花叶枯病及对该菌的开发利用提供理论依据。
    1 材料与方法
    1.1 病原菌分离鉴定与形态观察
    感病桂花叶片采自雅安市四川农业大学校园绿化带,参照方中达[5]的方法进行病原分离和纯化,并经柯赫氏假定确定病原菌菌株,采用PCA培养基进一步做形态观察[6,7]。
    1.2 生物学特性
    1.2.1 病原菌菌丝生长及产孢
    1.2.1.1 营养条件对病原菌的影响 将以下培养基分别制成固体及液体培养基,固体培养基接菌后在27℃下12h光暗交替培养,从第48小时开始,第24小时用“+”测量菌落直径,计测日生长量,观察菌落。第10天测产孢量,方法以30mL无菌水刮下菌落在搅拌器中搅拌20min将孢子洗下,纱布过滤后用血球计数板计数。每处理重复5次。液体培养基不加琼脂制成,300mL三角瓶中加入60mL培养液,接入菌丝块一块,27℃振荡(100r·min-1)培养,第5天测菌丝干重。每个处理重复3次。
    (1)PDA、PSA、PDBA(PDA+牛肉浸膏培养基)、PCA(马铃薯胡萝卜培养基)、CA(胡萝卜培养基)、OA(燕麦培养基)、CMA(玉米粉培养基)、OLA(桂花叶煎汁培养基)、WA(水琼脂培养基)及Cza-pek等10种培养基;(2)碳、氮源:以Czapek培养基为基础,按相同比例分别加入相同含碳量的木糖等14种碳源代替葡萄糖,以不加碳源为对照;以Cza-pek培养基为基础,按相同比例分别加入相同含氮量的(NH4)2SO4等14种氮源代替硝酸钠,以不加氮源为对照;(3)矿质营养:Czapek培养基中分别缺少供试的大量元素Na、K、P、Mg、Fe、S;Czapek培养基中分别加入5×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、2×10-8mol·L-1的Zn、Cu、Mn、Mo、B等微量元素,用重蒸水配制;(4)在Czapek培养基中,分别加入10mol·L-1Vb1、Vb2、Vb6、Ve、Vc、Vpp(烟酸),100mol·L-1复合Vb及1mol·L-1吲哚乙酸(IAA)。设不加生长物质的Czapek培养基为对照。1.2.1.2 环境条件对病原菌的影响 (1)pH值:将Czapek固体及液体培养基灭菌后在无菌条件下分别调pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,用同样的方法测菌落直径、产孢量及菌丝干重;(2)温度:Czapek固体培养基接种病原菌后分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃培养箱;(3)光照:Czapek固体培养基接种病原菌后分别置于27℃持续光照;27℃持续黑暗;27℃黑暗12h与光照12h交替;27℃室内自然光照下。
    1.2.2 病原菌分生孢子的萌发
    将分生孢子悬液分别进行以下处理,采用载玻片孢子萌发法,在不同时间镜检分生孢子萌发情况,计算萌发率。
    (1)用1%桂花叶汁、葡萄糖等不同营养物质配制分生孢子悬液;(2)温度设置为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃ ;(3)密封容器内用不同盐溶液控制相对湿度分别为55%、67%、76%、85%、90%、93%、98%、100%;(4)将分生孢子悬液在无菌条件下调pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12;5、将2mL孢悬液分别于45℃、55℃、65℃恒温水浴锅中处理10min、20min、30min。
    2 结果与分析
    2.1 病原菌鉴定结果与培养性状
    经柯赫氏假定确定为病原菌的菌株在PDA培养基上菌落平铺,圆形或近圆形,气生菌丝初为灰白色,后转为青褐色,培养基呈深青褐色近黑色。在PCA培养基上,4d左右便形成较长的分生孢子链,多数不分枝,分枝侧链均较短。分生孢子梗直立,分隔,淡褐色,30.0μm~76.5μm×3.5μm~5.5μm,分生孢子倒棍棒形或长椭圆形,褐色,成熟分生孢子具4-7个横隔膜,2个~4个纵或斜隔膜,常有1个~2个横隔较粗,孢身20.0μm~44.5μm×7.5μm~13μm,喙及假喙柱状,淡褐色,多数有分隔,部分假喙产孢部略膨大,3.0μm~14.5μm×2.5μm~4.5μm。上述特征基本符合细极链格孢[Alternariatenuissima(Fr.)Wiltshire]形态标准[6],因此将桂花叶枯病病原菌鉴定为细极链格孢。
    2.2 不同条件对菌丝生长及孢子形成的影响
    2.2.1 不同培养基
    细极链格孢在10种不同培养基中生长状况差异很大,细极链格孢菌在PDBA上菌丝干重最大,在PDBA、PDA、PSA上菌落直径最大,均达极显著水平。而在WA及OLA上菌丝干重最小,但在OLA上产孢最多,达极显著水平(参见表1)。
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    2.2.2 碳、氮源
    细极链格孢菌能利用多种碳、氮源,糊精促进菌丝生长作用极显著,却对产孢作用不大,可溶性淀粉较有利于菌丝生长,对产孢作用也达极显著水平,肌醇及山梨醇不利于菌丝生长,但促产孢作用极显著。
    有机氮有利于菌丝生长而对产孢的作用不一,蛋白胨及酵母浸出汁对促进菌丝生长作用极显著,蛋白胨对产孢作用极显著。铵盐既不利于菌丝生长也不利于其产孢,硝酸盐对菌丝生长作用不大,但较有利于孢子形成。谷氨酸为氮源的固体培养基不凝固,因此未测其产孢量(参见图1和图2)。
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    2.2.3 矿质营养
    在缺少大量元素试验中,培养基中缺Mg极不利于菌丝生长,缺K不利于产孢,而缺P能显著促进产孢,缺Na及Fe则对病原菌的生长及产孢无显著影响。
    微量元素试验中,添加5×10-5mol·L-1、2×10-8mol·L-1Zn及5×10-5mol·L-1Mn可促进菌丝生长但作用不显著,添加1×10-6mol·L-1Cu能显著促进其分生孢子产生(参见表2和表3)。
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    2.2.4 生长物质
    培养基中添加生长物质对菌丝生长作用不大,Ve对菌丝生长较有利,但不利于产孢,Vb2促产孢作用显著(参见图3)。
    2.2.5 pH值
    不同pH值对细极链格孢菌生长及产孢都有一定影响,该菌对偏酸的环境更敏感,pH5~10时链格孢菌生长较好,其中最适pH值为6。pH为3~12链格孢菌均能产孢,而以pH6~11产孢量较大,其中pH7最适合产孢。
    试验中还发现,在pH≤8的培养基上,菌丝生长较快较稳定,平均生长速率为9.75mm·d-1,在pH9~12培养基上,培养前3d菌丝生长较慢,平均生长速率为6.4mm·d-1,之后菌丝生长速率提高,平均生长速率为7.7mm·d-1,此外液体培养5d后,原pH值大于8的液体培养基pH值均趋于7~8(参见图4)。
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    2.2.6 温度
    细极链格孢菌可在较宽的温度范围内生长,从5℃ ~35℃都能生长,其生长适温为20℃ ~30℃ ,最适生长温度为23℃ ~27℃。链格孢菌对低温不太敏感,而对高温很敏感,温度达35℃时,生长急剧减少,温度为40℃时菌丝停止生长。
    不同温度对链格孢菌生长和产孢作用不同,在5℃ ~35℃均能产孢,其中15℃和30℃适合产孢,30℃时产孢量最大(图5)。
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    2.2.7 光照
    细极链格孢菌在24h黑暗处理中菌落直径及产孢量均达最大,而在24h光照处理中,菌落直径较大但产孢量最低,室内自然光照处理较有利于产孢但对菌落直径的增长促进不显著,12h光暗交替对链格孢菌生长及产孢均无较大促进作用(参见表4)。
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    2.3 不同条件对病原菌分生孢子萌发的影响
    2.3.1 介质/营养
    各种介质除NH4Cl、NH4NO3、NaNO3不利于孢子萌发外,其余介质均可促进孢子萌发,桂花叶汁、蔗糖、葡萄糖、牛肉浸膏促进孢子萌发效果最好,6h后萌发率均达到80%以上(参见图6)。
    2.3.2 温度
    细极链格孢菌分生孢子在5℃ ~40℃均能萌发,其中23℃ ~30℃时分生孢子能较快较好地萌发,其中27℃为最适温度(参见图7)。
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    2.3.3 湿度
    细极链格孢菌分生孢子萌发对湿度要求较高,湿度为93%时,少数孢子萌发,但24h后萌发率仍不到1%,湿度为98%和100%时,分生孢子萌发率最高,24h后能达到70%左右,其中湿度为98%时的孢子萌发率略高于100%时的孢子萌发率(图8)。
    2.3.4 pH值
    细极链格孢菌能承受的pH值范围较宽,本试验中除pH2的孢悬液中,分生孢子几乎不萌发外,其余pH值孢悬液中分生孢子都能萌发,适宜的萌发范围为pH3~7(图9)。
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    2.3.5 分生孢子致死温度
    细极链格孢菌分生孢子在45℃水浴中处理10min、20min、30min后分生孢子仍具有一定活性,但与对照相比已显著降低。分生孢子在55以上水浴中处理后,分生孢子不再萌发,因此分生孢子致死温度为55℃处理10min(图10)。
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    3 讨论
    通过对采集到的桂花病叶进行分离纯化和鉴定,确定导致雅安市桂花叶枯病的病原菌是细极链格孢[Alternariatenuissima(Fr.)Wiltshire],目前已发现细极链格孢能引起冬枣[8]、小麦[9,10]、金钗石斛[11]、蚕豆[12]、绿穗苋[13]等的病害。
    细极链格孢菌在PDBA、PDA、PSA培养基上菌丝生长最好,而在桂花叶汁培养基上产孢量最大,且在桂花叶汁中分生孢子萌发也更快,说明桂花汁液能促进其产生大量分生孢子及孢子萌发,在生长季中发生再侵染使病害能迅速流行。该菌能利用多种碳、氮源,但铵盐能抑制其菌丝生长、产孢及孢子萌发,因此在施氮肥时应以铵态氮为主,或者使用氯化氨、硫酸氨等作为增效剂来提高化学药剂和生物农药对桂花叶枯病的防治效果。
    培养基中缺P有助于产孢,因此在生产实践中施磷肥有助于减轻桂花叶枯病的发生。培养基中添加微量元素和生长因子对细极链格孢菌菌丝生长作用不显著,但培养基中添加5×10-5mol·L-1Cu、10mg·L-1Vb2有利于产孢且达极显著水平。
    细极链格孢菌能在较大的pH范围内生长并产孢,但其对偏酸的环境更敏感。而其分生孢子在偏酸的条件下更有利于萌发。该菌在碱性条件下培养后期生长速率加快,而且原pH值大于8的液体培养基培养之后pH值均趋于7~8,这与王宏[14]研究梨黑斑病病原菌链格孢(Alternariaalternate)的结果相似。可能的原因是该菌菌丝生长过程中产生的物质可改变培养液的pH值从而有利于该菌良好生长,曾有报道表明病原菌能调节寄主植物的pH值从而作为增加毒力的一个机制[15]。
    细极链格孢菌适应性强,在5℃ ~35℃的温度范围内均能生长并产孢,生长最适温为27℃ ,与金钗石斛黑斑病病原细极链格孢生长适温为25℃的结果相似[11]。当温度稍偏低或稍偏高时更有利于其产孢。24小时黑暗处理的菌落直径及产孢量均最大,说明光照可能对该菌生长及孢子形成有一定抑制作用,而桑维钧[11]研究认为光照对细极链格孢生长无影响,这可能是因为两者属于不同的生理小种。
    细极链格孢菌分生孢子在98%以上的高湿环境下才能正常萌发,因此在生产实践中应注意排水及修枝,保持通风干爽的环境,可以减少该病的发生。

参考文献:
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[12] 王 宏,常有宏,陈志谊.梨黑斑病病原菌生物学特性研究[J].果树学报,2006,23(2):247~251.

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